不同真空處理時間對辣根過氧化物酶二級結構的影響

　　辣根過氧化物酶經真空處理不同時間，利用圓二色光譜研究不同真空處理時間對辣根過氧化物酶二級結構的影響。結果表明：在3~15 min 時間內，不同真空處理時間對辣根過氧化物酶的α- 螺旋、β- 折疊、β- 轉角及無規(guī)卷曲相對含量產生不同程度的影響，但是影響程度較小，表明辣根過氧化物酶二級結構相對力學作用具有較高的穩(wěn)定性。

　　離子注入技術作為有效改善材料表面性能的表面改性技術，已廣泛應用于半導體材料摻雜，金屬、陶瓷、高分子聚合物等諸多材料的表面改性中。20 世紀80 年代，中國科學家進行了低能離子注入生物體效應的研究與探索，研究結果已被成功地應用于農作物改良、細胞刻蝕和轉基因工程等方面。低能離子注入生物體效應機理的研究也取得了部分結果，理論上提出了低能離子與生物體作用時的能量沉積、質量沉積、動量交換和電荷交換等四因子觀點，實驗上發(fā)現了低能離子注入對酶活性的影響、細胞核和細胞質的誘變作用以及致使DNA 堿基多位點、高密度變異等。這些結果為離子注入生物效應提供了重要的理論依據。但是由于離子束技術本身的原因，離子束對樣品的處理是在真空中進行的。那么，真空本身對生物體是否存在影響，是值得探討的問題。

　　酶在生命活動過程中，扮演著極其重要的角色。理論研究表明，酶蛋白的空間結構對酶的功能至關重要，即使極其細微的擾亂，也能夠極大地影響酶的活性。酶蛋白不是剛性分子，它的功能依賴于結構的這種運動性。光譜技術是研究生物蛋白質構象的一種有效途徑，其中圓二色(Circular Dichroism 簡寫為CD)光譜可以靈敏地反映出蛋白質構象的變化,已被廣泛應用于蛋白質的構象研究中。

　　本文以HRP(辣根過氧化物酶)為研究對象，將酶蛋白置于離子注入時的真空條件下在不同時間，研究不同真空處理時間對其二級結構的影響。研究結果對離子注入生物體效應的機理分析與應用研究具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1、材料

　　辣根過氧化物酶結晶粉末(購自于北京拜爾迪生物技術公司，RZ≥3.0 單位酶活/mg)。主要試劑：30% 過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等。

1.2、實驗設備

　　離子注入機（中國科學院等離子物理研究所）、圓二色光譜儀（Jasco- 715 型，日本Jasco 公司）、紫外- 可見分光光度計（VIS- 723G 型，北京瑞利分析儀器公司）、精密酸度計（PHS- 2C 型，上海康儀儀器有限公司）、電子天平（BP310S 型，北京塞多利斯儀器系統有限公司）。

1.3、實驗方法

1.3.1、樣品的處理

　　取一定質量的測試樣品放置于培養(yǎng)皿中,樣品面積約6 cm2。將樣品置于離子注入機靶室中對樣品進行處理，待真空度達到10- 3 Pa 時（離子注入真空條件）開始計時，真空處理樣品時間分別取t＝3 min，6 min，9 min，12 min 和15 min。

1.3.2、 CD 譜測定

　　CD 光譜分析的酶液濃度為0.2 mg/ml（使用0.05 mol/L，pH=7.3 的PBS 溶解）。石英樣品池的光程為0.1 cm，靈敏度為2 mdeg/cm，掃描測定波長范圍為190~250 nm，掃描時間0.5 s,掃描速度為3.3 nm/s，分辨率為0.01 mdeg，在室溫下進行測定。CD 譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg·cm2·dmol- 1，所有圓二色數據經四次掃描取平均值。得出CD 譜后，用Selcon3[8,9]軟件計算辣根過氧化物酶的二級結構含量。

3、討論

　　蛋白質的二級結構是指多肽鏈骨架中局部肽段的構象，α- 螺旋和β- 折疊結構中存在較多的氫鍵，導致規(guī)則二級結構具有一定的剛性；β- 轉角以及無規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其它的相互作用，使肽段中的各個殘基間有更大的自由度，沒有剛性，從而表現出極大的柔性。蛋白質分子中α- 螺旋、β- 折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內部的氫鍵。氫鍵在蛋白質的結構和功能中，尤其是二級結構的形成中非常重要。水分子的存在可以增加氫鍵形成的幾率，真空處理辣根過氧化物酶過程伴隨脫水的過程。由于水分子的減少，形成氫鍵的幾率降低，因此蛋白質二級結構會發(fā)生變化。本文研究結果表明，真空對辣根過氧化物酶作用過程中，α- 螺旋、β- 折疊、β-轉角以及無規(guī)卷曲使隨著不同真空處理時間的增加，呈非單調型變化，但是變化幅度不大。表明辣根過氧化物酶二級結構相對力學作用具有較高的穩(wěn)定性。在3～15 min 的真空條件下，辣根過氧化物酶經真空處理后其相對活性基本上降低。這可能是由于真空作用對HRP 高級結構的微擾，使HRP 活性中心卟啉環(huán)的微結構發(fā)生了變化，導致HRP 的相對活性降低。

　　我們的研究結果表明，在離子注入生物效應的研究中，應該考慮真空對生物體所產生的影響，不能完全歸之于注入離子的生物效應。