不同真空處理時(shí)間對SOD、HRP和α-AMY活性的影響

　　將超氧化物歧化酶（SOD）、辣根過氧化物酶（HRP）和淀粉酶（α- AMY）置于真空環(huán)境中不同時(shí)間，測試真空對超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶活性的影響。不同真空處理時(shí)間對酶蛋白活性有不同影響，在處理時(shí)間為3～15 min 范圍，超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶相對活性基本上都呈降低的趨勢。因此，在離子注入生物效應(yīng)的研究中，應(yīng)該考慮真空對生物體所產(chǎn)生的影響。

　　低能離子注入生物技術(shù)已被成功地應(yīng)用于農(nóng)作物改良、細(xì)胞刻蝕和轉(zhuǎn)基因工程等方面。目前，對其機(jī)理的研究多集中在細(xì)胞和個(gè)體水平上，對分子水平上的輻照損傷如DNA 鏈的斷裂、核甘酸和堿基損傷的研究也取得了一定的進(jìn)展。但由于離子注入過程是在真空條件下進(jìn)行的，那么，真空本身對生物體特別是生物大分子是否存在影響， 是值得研究的一個(gè)問題。本文以SOD(超氧化物歧化酶)、HRP(辣根過氧化物酶)和α- AMY(α－淀粉酶)為研究對象，將酶蛋白置于離子注入時(shí)的真空條件下不同時(shí)間， 研究了不同真空時(shí)間對其活性的影響。研究結(jié)果對離子注入生物體效應(yīng)的機(jī)理分析與應(yīng)用研究具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1、材料

　　辣根過氧化物酶結(jié)晶粉末(購自于北京拜爾迪生物技術(shù)公司，標(biāo)定酶活力為250 u/mg)；超氧化物歧化酶(購自于華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，標(biāo)定酶活力為1000 u/mg)；α- 淀粉酶(購自于Sigma 公司，標(biāo)定酶活力為1.8 u/mg)。

1.2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備

　　紫外- 可見分光光度計(jì)（TU- 1800PC 型，北京譜析通用公司）、精密酸度計(jì)（PHS- 2C 型，上海康儀儀器有限公司）、電子天平（BP310S 型，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3、實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1、樣品的處理

　　取一定質(zhì)量的測試樣品放置于培養(yǎng)皿中，樣品面積約6 cm2，厚度大約1.0 mm。將樣品置于離子注入機(jī)（中國科學(xué)院等離子研究所）靶室中對樣品進(jìn)行處理，待真空度達(dá)到10^{- 3} Pa 時(shí)（離子注入真空條件），開始計(jì)時(shí)，真空處理樣品時(shí)間分別取t＝3 min，6 min，9 min，12 min，15 min。

1.3.2、活性的測定

　　SOD 活性的測定按季鍵平的方法進(jìn)行；HRP 活性測定按張龍翔的方法進(jìn)行；α－淀粉酶按李合生方法進(jìn)行。酶蛋白的相對活性定義為：

　　其中At 為處理組樣品活性，A0 為對照組樣品活性。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1、真空對超氧化物歧化酶活性的影響

　　圖1 給出不同真空處理時(shí)間對超氧化物歧化酶相對活性的影響。可以看出，不同處理時(shí)間入對超氧化物歧化酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，真空處理時(shí)間為6 和9 min 時(shí)，酶相對活性分別增加了為49.7%和39.3%；真空處理時(shí)間為3、12 和15 min 時(shí)，酶相對活性分別降低了35.8%、73.1%和48.4%。

圖1 不同真空時(shí)間對SOD 相對活性的影響

2.2、真空對辣根過氧化物酶活性的影響

　　圖2 給出了不同真空處理時(shí)間對辣根過氧化物酶相對活性的影響。結(jié)果表明，不同處理時(shí)間對辣根過氧化物酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，辣根過氧化物酶經(jīng)真空處理后其相對活性均降低，降低幅度在1.0%～40.2%，其中處理時(shí)間為6 min 時(shí)，降幅最小，處理時(shí)間為9 min 時(shí)，降幅最大，但在處理時(shí)間為3 min時(shí)，相對酶活性增加26.2%。

圖2 不同真空時(shí)間對HRP 相對活性的影響　圖3 不同真空時(shí)間對α－AMY 相對活性的影響

2.3、真空對α－淀粉酶活性的影響

　　圖3 給出了不同真空處理時(shí)間對α－淀粉酶相對活性的影響。可以看出，不同處理時(shí)間入對α－淀粉酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，α－淀粉酶經(jīng)真空處理后其相對活性均降低，降低幅度在2.4%～25.7%，其中處理時(shí)間為12 min 時(shí)，降幅最小，處理時(shí)間為15 min 時(shí)，降幅最大。

3、討論

　　已有研究表明：離子注入干種子過程中一般含水量損失大約50%；當(dāng)細(xì)胞或愈傷組織突然暴露于真空靶室時(shí)，由于表面水分的蒸發(fā)帶走了大量的汽化熱，細(xì)胞或愈傷組織自身溫度迅速的下降，當(dāng)達(dá)到相平衡時(shí)，兩相界面的溫度應(yīng)降至0℃以下。可知此時(shí)的細(xì)胞或愈傷組織表面的水分早已形成冰殼。如果維持真空度不變（蒸汽壓不變），則冰殼表面的溫度不變。在熱傳導(dǎo)的作用下，整個(gè)愈傷組織和細(xì)胞的水分將結(jié)冰。在進(jìn)行離子注入活體生物實(shí)驗(yàn)時(shí)，生物活體不僅散失大量的水分，而且還受到冷凍的影響。

　　真空處理過程必然伴隨脫水的過程。水分子的存在可以增加氫鍵形成的幾率，當(dāng)兩個(gè)球蛋白分子在水溶液中互相靠近時(shí)，由于水分子的作用，蛋白分子相應(yīng)肽段之間形成一定形式的β 折疊，這種β 折疊比正常的分子內(nèi)β 折疊的能量高，穩(wěn)定性較低。從能量角度講α- 螺旋比β-折疊穩(wěn)定，而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)是最不穩(wěn)定的。因此從這個(gè)意義上考慮, 超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶在真空過程中可能由于有序結(jié)構(gòu)含量的減少，無序結(jié)構(gòu)含量的增加導(dǎo)致了其相對活性的下降。

　　我們的研究結(jié)果表明，在離子注入生物效應(yīng)的研究中，應(yīng)該考慮真空對生物體所產(chǎn)生的影響，不能完全歸之于注入離子的生物效應(yīng)。